COMUNICACIONES ORALES CLONACIÓN GAMÉTICA POR GENERACIÓN DE ANDROGENOTAS CO-028 HUMANOS: CARACTERIZACIÓN GENÉTICA Y EDICIÓN GENÓMICA POR CRISPR-CAS9 MJ. Escribà Pérez (1), R. Bautista Llácer (2), N. Grau Grau (1), A. Oller (2), L. Escrich Albelda (1), X. Vendrell Montón (2) (1) IVI Valencia, Fundación IVI - Valencia (Valencia), (2) Sistemas Genómicos - Paterna (Valencia) INTRODUCCIÓN: RESULTADOS: La clonación, entendida como la multiplicación asexual de una Fase I: Cada androgenota analizado mostró homogeneidad entidad genética, provoca un intenso debate tanto en la inves- intra-androgenota en términos de ploidía, con fórmulas 23,X tigación básica como en su aplicación terapéutica y clínica en y 23,Y. Fase II: El estudio de aCGH en célula individual exhibió humanos. La tecnología de trasplante nuclear se ha aplicado androgenotas uniformes en 4/6 (tres 23,Y y uno 46,XX), y dos para la mejora de la calidad citoplasmática ovocitaria y para la aneuploides. Fase III: 9/18 mostraron el alelo normal para HBB sustitución mitocondrial completa por spindle transfer. En este y 8/18 el alelo mutado. Además, el análisis individual de las cé- contexto, presentamos una nueva aplicación: la generación de lulas constituyentes sugiere la isogenicidad de la muestra. En embriones androgenotas como una nueva posibilidad para la total, el 87.5% (35/39) fueron haploides (23,X:23,Y; 20:15), tres clonación del gameto paterno. Metodológicamente se basa en autodiploidizados (dos 46,YY, uno 46, XX) y un triploide 69,YY0. la microinyección espermática en ooplastos (ovocitos MII pre- El 70.8% (17/24) mostró fórmulas cromosómicas 46,XX o 23,Y; viamente enucleados), cuya ulterior activación permite el desa- siendo 47.0% (8/17) portadores de la variante patogénica. Dieci- rrollo mitótico uniparental. El estudio del desarrollo androgeno- séis androgenotas con información genética completa (ploidía, ta inicial (día 3) sugiere que los androgenotas están compuestos fórmula cromosómica y estudio del HBB) rindieron 7 androge- por células haploides, que pueden ser reclutadas como modelo notas haploides, con alelo normal HBB y 46,XX y 23,Y (3:4). Fase de estudio del gameto masculino o con finalidad reproductiva. IV: Todos los androgenotas mostraron el polimorfismo c.9T>C. El análisis de las células individuales en 4 androgenotas mostró OBJETIVO: células isogénicas, sin quimerismo intra-androgenota. Tras la coinyección del gRNA, sc-DNA y CRISPR-Cas9 con el espermato- Validación del modelo androgenota mediante caracterización zoide (Fase IV), 3/32 androgenotas mostraron c.27dupG (9.4%), genética (ploidía, formula cromosómica y fingerprinting). Adi- siendo 90.6% (29/32) no portadores de la variante patogénica cionalmente, empleando el modelo androgenota, se explora en HBB; un porcentaje llamativamente superior a los controles un sistema de edición genómica basado en CRISPR-Cas9 para (12/23; 52.2%). Tras la secuenciación, observamos 3 grupos de corregir variantes patogénicas de origen espermático. respuesta, en relación a la edición: delecciones (25%), edición ineficiente (polimorfismo c.9T>C persistente; 50%) y edición efi- MATERIAL Y MÉTODO: ciente (25%). Se generaron embriones androgenotas a partir de un paciente CONCLUSIONES: heterocigoto para la variante patogénica c.27dupG en el gen HBB responsable de la beta-talasemia y homocigoto para el po- Los androgenotas mostraron la existencia de isogenicidad y limorfismo c.9T>C en el mismo gen. El estudio genético de los autodiploidización, sugiriendo su sentido como tecnología de androgenotas se realizó en día 3, analizando la ploidía (fase I; n=6),clonación gamética. El estudio de regiones génicas permitió fórmula cromosómica mediante aCGH (fase II; n=6) e identidad establecer la segregación de variantes concretas, pudiendo genética por estudio de polimorfismos STRs (fase III; n=18), desti- corregirse mediante técnicas de edición genómica y rindiendo nando en las fases II y III al menos una célula para control de ploi-células únicas haploides y reparadas, aun con baja eficiencia da- día mediante FISH. La edición del genoma espermático se realizó dos los efectos off-target. Este trabajo presenta un modelo para coinyectando el espermatozoide con una mezcla de g-RNA, una el estudio del gameto paterno y abre la puerta a la generación secuencia de ADN donante de cadena sencilla y CRISPR-Cas9 preconcepción de células haploides corregidas, procedentes de durante la ICSI. En día 3, los androgenotas fueron analizados por varones portadores de enfermedades monogénicas. secuenciación para las variantes del gen HBB (fase IV; n=32). 111 ASEBIR. Revista de Embriología Clínica y Biología de la Reproducción. Noviembre 2021 Vol. 26 Nº 2